Análise genômica funcional
A genômica funcional possibilita a descoberta de função e envolvimento gênicos nas vias bioquímicas, celulares e fisiológicas. A disponibilidade de sequências genômicas completas, combinada com ferramentas prontamente programáveis para modificar o genoma, permite que essas análises sejam realizadas em uma escala que engloba todo o genoma. O objetivo básico de uma análise genômica é entender o surgimento de um fenótipo específico através da modificação da função de um gene de maneira direcionada e intencional. Quando genes individuais são deletados ou modulados em uma célula ou organismo, alterações no fenótipo ou comportamento podem ser observadas direta ou indiretamente por meio de experimentos cuidadosamente planejados. A análise genômica funcional permite que esse processo seja realizado de maneira sistemática e paralelizada, elucidando vias complexas e estados de doenças e facilitando a identificação de novos alvos de medicamentos.
Há duas formas fundamentais pelas quais a genômica funcional pode relacionar a genética com o fenótipo. A análise genética direta envolve a modificação de vários genes, selecionando as células ou organismos com o fenótipo de interesse e, em seguida, identificando os genes cuja modulação desencadeia a alteração fenotípica. A análise genética reversa avalia o fenótipo de células ou organismos após uma interferência em um gene específico ou combinação de genes.
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Avanços nas tecnologias de edição, silenciamento e modulação gênicos, sequenciamento de próxima geração (NGS) e análise fenotípica possibilitam uma execução eficiente de análises genômicas funcionais em diversos sistemas modelo.
- interferência por RNA (RNAi): Podem ser empregados diversos tipos de reagentes RNAi para silenciamento gênico, inclusive RNA dupla-fita (dsRNA) longo, RNA de interferência pequeno (siRNA) sintético e RNA de interferência pequeno em forma de grampo (shRNA). Esses reagentes RNAi são introduzidos nas células por transfecção direta do fator de modulação (siRNAs e dsRNAs), por transfecção do DNA que codifica um shRNA orientado por promotores ou por métodos de transdução viral com o uso de construtos de lentivírus com cassetes de shRNA clonados. O dsRNA e o siRNA podem ser usados em análises em arranjo para a obtenção de uma análise de alto rendimento, ao passo que shRNAs podem ser introduzidos em populações celulares em análises em arranjo ou agrupadas para gerar análise de alto rendimento, sendo que as análises agrupadas utilizam sequenciamento de próxima geração (NGS) para deconvolução.
- Sistemas CRISPR-Cas: Os sistemas CRISPR (repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas) podem ser usados para manipular os genomas, transcriptomas e epigenomas de células de mamíferos. Na edição gênica por CRISPR-Cas9, uma nuclease Cas9 é direcionada a um loco específico com o uso de um RNA-guia. Dependendo da variante de Cas9 empregada, a CRISPR pode ser usada para silenciar geneticamente a produção de transcritos com a introdução de mutações de modificação da fase de leitura (“frameshifts”), repressão da maquinaria de transcrição, recrutamento dos fatores de transcrição para ativar a expressão, indução de mutações de ponto específicas ou modificação de marcadores epigenéticos. De modo semelhante ao RNAi, pode-se introduzir CRISPR diretamente como um complexo da RNP em análises em arranjo ou como DNA de plasmídeo ou lentivírus para aplicações tanto em análise agrupada como em arranjo. Grupos, bibliotecas e arranjos de CRISPR facilitam a análise incrivelmente versátil e de alto rendimento de genes para análise funcional. A análise de modulação genômica também é possível com um sistema CRISPR sem nucleases que utiliza dCas9 enzimaticamente inativa em combinação com efetores transcricionais que ativam (CRISPRa) ou inibem (CRISPRi) a transcrição gênica, levando a um aumento ou diminuição da expressão gênica.
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