qPCR
A PCR quantitativa (qPCR) em tempo real usa sondas moleculares fluorescentes para permitir a quantificação de produtos amplificados. Assim como na PCR convencional, um molde de DNA, cDNA ou RNA é amplificado, mas em cada ciclo sinais fluorescentes são monitorados para quantificação absoluta ou relativa.
Essa técnica é útil parra diversas áreas de pesquisa, inclusive análise de expressão gênica, genotipagem, análise de microRNA, análise de variação genética e análise proteica.
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A reação em cadeia da polimerase (PCR) é um dos pilares dos laboratórios de biologia molecular. A PCR é usada para amplificar DNA em diversas ordens de magnitude e nossos reagentes e recursos são adequados para vários fluxos de trabalho de pesquisa, incluindo as demandas de aplicações em análise de expressão gênica, genotipagem, sequenciamento e mutagênese.
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Como analisar os dados de qPCR
A fluorescência das sondas moleculares é medida e quantificada; em geral, elas são corantes (ou seja, SYBR® green, brometo de etídio) que se intercalam entre as bases no DNA dupla-fita, ou sondas projetadas para se ligar a uma sequência específica (ou seja, sondas do tipo faróis moleculares (“Molecular Beacons”), TaqMan®) no DNA.
Quantificação relativa dos dados de qPCR
Há dois métodos principais de quantificação dos dados de qPCR. A quantificação relativa, que é o método mais comum, usa informações ΔΔCt, pelas quais a proporção de expressão ou abundância do gene-alvo na amostra é determinada, comparada a um gene controle e normalizada com a proporção de expressão de um gene de referência. Assim, os valores E de eficiência dos genes-alvo e de referência diferem, esse método também leva em consideração as diferenças nos valores de E. Esse método é empregado mais frequentemente em análise de expressão gênica.
Quantificação absoluta dos dados de qPCR
O segundo método, quantificação absoluta, é mais comum em microbiologia ambiental e faz uso da curva padrão (SC). O método da SC usa séries de diluição de concentração de molde conhecida, N0, para criar uma curva padrão utilizando a regressão linear de log(N0) em relação ao CT (ciclo limiar). Em seguida, esta é usada para calcular as concentrações de molde da amostra. A base desse método é que o valor de eficiência da amostra seja o mesmo que do padrão.
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