Interações entre proteínas e ácidos nucleicos
As proteínas são as moléculas “pé de boi” em uma célula e são responsáveis pelas inúmeras atividades biológicas que as células realizam para funcionar e sobreviver. Curiosamente, um conjunto diversificado de proteínas também interage com o DNA. O DNA dentro de nossos cromossomos é frequentemente bem empacotado em torno de proteínas conhecidas como cromátides dentro do cromossomo. Esses agrupamentos de proteína-DNA ajudam a empacotar o DNA em uma forma compacta no interior do núcleo celular. Ferramentas e técnicas moleculares poderosas foram desenvolvidas por pesquisadores para isolar esses agrupamentos de proteína-DNA e outros complexos proteicos que se ligam ao DNA para outras aplicações a jusante (downstream).
Imunoprecipitação
Com a imunoprecipitação usando anticorpos altamente específicos para proteínas de ligação ao RNA e DNA (por exemplo, fatores de transcrição), os cientistas podem avaliar a regulação das vias moleculares e entender melhor a função gênica em tecidos saudáveis e doentes.
Inúmeras tecnologias e métodos estão disponíveis atualmente para investigar interações proteína-RNA e proteína-DNA e são adequados para análises a jusante (downstream) adicionais. Por exemplo, os ensaios de imunoprecipitação de cromatina (ChIP) são frequentemente usados para investigar as interações de fator de transcrição-DNA para estudos de expressão gênica e de modificação epigenética. Por outro lado, os ensaios de precipitação de RNA (RIP) são comumente usados para investigar proteínas que se ligam a mRNAs, RNAs não codificantes, miRNAs e RNAs virais. Um desafio comum em estudos de imunoprecipitação é a especificidade e/ou o acesso do anticorpo à proteína de interesse. Para contornar alguns desses problemas, pesquisadores usam a tecnologia de proteína recombinante para expressar proteínas modificadas com caudas exclusivas, como a cauda de hemaglutinina (HA), que são reconhecidas com alta especificidade pelo anticorpo adequado.
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Tecnologia de ensaio de ligação por proximidade
Curiosamente, cientistas criaram, usando as tecnologias de proteína-DNA, novas ferramentas e métodos para avaliar as interações proteicas. Com alta especificidade e sensibilidade, a tecnologia de ensaio de ligação por proximidade (PLA) facilita a detecção de proteínas endógenas, modificações proteicas e interações proteicas in situ. De modo semelhante às técnicas de imunoprecipitação, o ensaio de PLA utiliza anticorpos primários altamente específicos para reconhecer as duas proteínas de interesse. No entanto, anticorpos secundários modificados marcados com oligonucleotídeo, funcionando como a sonda de PLA, são usados para se ligar aos anticorpos primários. Somente se ambas as proteínas estiverem presentes e próximas é que os oligonucleotídeos conectores de hibridização se unem às sondas de PLA. A adição de ligase forma um molde de DNA circular fechado. Com o molde de DNA circular recém-formado, a amplificação do círculo rolante torna-se viável com a adição de DNA polimerase e, por fim, gera um sinal muito amplificado que está associado à sonda de PLA. A escolha da tecnologia de interação entre proteínas e ácidos nucleicos adequada será determinada em grande parte pelas necessidades de aplicação a jusante do pesquisador.
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