Caractérisation biopharmaceutique

Caractérisation et analyse des produits biologiques et des biosimilaires

L'analyse et la caractérisation des médicaments biologiques nécessitent des méthodes analytiques extrêmement sophistiquées, et s'inscrivent dans le cadre strict des BPF et de la réglementation. Le développement d'une biothérapie ou d'un biosimilaire original requiert des études de caractérisation du produit pour garantir un médicament biologique robuste et bien spécifié.

Identité

Détermination de la masse intacte

La détermination de la masse moléculaire intacte, souvent réalisée par SEC-MS avec des étalons appropriés, est une étape nécessaire de la caractérisation des produits biologiques, de la sélection du clone à la vérification du produit final. L'analyse de la masse moléculaire intacte est couramment utilisée pour démontrer la diversité des produits protéiques/peptidiques et vérifier l'identité des produits biologiques. Avec une certaine optimisation, elle peut également permettre de déterminer la masse moléculaire intacte de tous les produits protéiques, y compris les anticorps monoclonaux bispécifiques.

Plutôt que de s'attaquer à la masse intacte, difficile à manier, d'un composé biologique protéique de grande taille, il vaut mieux adopter une approche analytique impliquant une digestion protéique, consistant tout d'abord à cliver l'échantillon en quelques fragments seulement, après quoi la séparation peut être gérée de manière individuelle avec des étalons protéomiques de spectrométrie de masse spécialisés.

Mesure du titre

La productivité de la lignée cellulaire, en termes de capacité à fournir des quantités suffisantes de mAb, influence son potentiel commercial. Utilisé comme valeur de référence, le titre est mesuré par chromatographie d'affinité sur protéine A (HPLC). Au début du développement des mAb, il était nécessaire de mesurer le titre d'IgG d'un grand nombre d'échantillons de cultures cellulaires destinées à être récoltées (HCC). La chromatographie d'affinité employant la protéine A comme ligand est souvent utilisée pour déterminer la concentration du mAb et le purifier en vue d'une analyse downstream des agrégats et des variants de charge.

Analyse des acides aminés

L'analyse des acides aminés est un moyen populaire d'établir l'identité d'un produit. Elle permet d'identifier les acides aminés composant un mAb. Elle est souvent effectuée parallèlement à une mesure du coefficient d'extinction, méthode couramment employée pour établir le titre entre différentes productions.

L'emploi de matériaux de référence certifiés, dont les valeurs sont assignées via des méthodes valides sur le plan métrologique, est essentiel pour réduire au minimum et maîtriser les variations expérimentales à toutes les étapes de l'analyse des acides aminés, notamment lors de l'extraction des protéines, du fractionnement, de l'enrichissement, de la protéolyse et de l'analyse.

Cartographie peptidique

Pour obtenir des indications sur l'identité du mAb, une comparaison de cartes peptidiques mono-enzymatiques simples peut être suffisante. Une caractérisation plus poussée de l'anticorps thérapeutique, avec par exemple un séquençage N ou C-terminal, une caractérisation des glycanes, et d'autres aspects de la production, de l'analyse, de la purification et de la fragmentation de l'anticorps peuvent donner des informations plus détaillées sur l'ingénierie du produit. La spectrométrie de masse appliquée à la protéomique fournit des informations structurelles supplémentaires.

Modification post-traductionnelle

Analyse des N-glycanes

une glycosylation hautement variable peut avoir une incidence sur la pureté des mAb et produire une fonction variable. Les anticorps monoclonaux comportent sur leur squelette des N-glycanes qui peuvent être libérés par LC-MS pour évaluer les schémas de glycosylation. Il est nécessaire de caractériser les N-glycanes d'un anticorps monoclonal pour connaître tous les détails structuraux de la molécule étudiée. Comprendre les voies de ces N-glycanes est important, car les N-glycanes influent sur de nombreuses propriétés des glycoprotéines, notamment leur conformation, leur solubilité, leur antigénicité et leur reconnaissance par les protéines se fixant aux glycanes.

Comparaison de la structure d'ordre supérieur (HOS) des anticorps monoclonaux (mAb)

De nombreux facteurs influent sur la HOS, autrement dit la structure 3D d'un mAb. Cela peut aller du choix de la lignée cellulaire pour la production du mAb, aux conditions des procédés biotechnologiques telles que la température, le pH et l'exposition à la lumière. La spectrométrie de masse avec échange d'hydrogène/deutérium (HDX-MS) est une méthode permettant d'obtenir des informations détaillées sur la structure tertiaire du mAb.

Analyse des modifications des mAb

De nombreuses modifications post-traductionnelles différentes peuvent se produire au cours du procédé de fabrication des mAb. Ces modifications sont largement influencées par les paramètres opérationnels tels que le milieu, la température, etc. Pour obtenir un produit régulier et homogène, il est essentiel de reproduire ces modifications lors de chaque nouvelle synthèse du mAb. L'analyse des modifications comprend la cartographie des ponts disulfures et l'évaluation de la structure de base des glycanes. Il est également judicieux de quantifier la sialylation, car l'acide sialique peut avoir un effet négatif sur le mAb.

Répartition de la charge des mAb

Suite aux modifications post-traductionnelles (MPT) ou à des modifications chimiques, les variants de charge peuvent avoir un impact considérable sur l'activité biologique et la pharmacocinétique d'un mAb. L'analyse des variants de charge des mAb, qui est une exigence réglementaire, peut se faire via des techniques telles que la chromatographie d'échange de cations (CEX) ou la focalisation isoélectrique capillaire (cIEF).

Tests physiques et distribution granulométrique des mAb

Tests physiques des mAb

Les tests physiques permettent de caractériser l'aspect d'un mAb. Il peut s'agir par exemple de la mesure du pH, de l'osmolalité ou de la concentration. L'intégrité de l'enveloppe est également évaluée dans le cadre du protocole de tests physiques, par exemple avec la détermination de la teneur en eau par Karl Fischer ou de la pénétration de colorants pour confirmer l'intégrité de la barrière.

Distribution granulométrique des HmAb

Bien que l'on cherche à obtenir un mAb unique, le matériel de production initial contient souvent des variants de taille tels que des agrégats, des fragments et des biomolécules présentant des chaînes légères supplémentaires. Comme ceux-ci peuvent affecter l'immunogénicité et l'activité, il est important de surveiller leur présence. La chromatographie d'exclusion stérique (SEC) est la méthode la plus couramment employée pour évaluer la distribution granulométrique. 

Stérilité et impuretés

Impuretés protéiques provenant des cellules hôtes

Les impuretés protéiques issues des cellules hôtes (HCP), présentes à des niveaux de l'ordre du ppm dans les biothérapies, constituent un risque majeur d'immunogénicité, car elles peuvent déclencher une réponse immunitaire imprévisible chez les patients. Leur nature complexe et diverse les rend difficiles à détecter ou à surveiller. Même si la plupart des impuretés HCP est effectivement éliminée dans les procédés de purification downstream, une petite population de HCP constitue un vrai problème. Issue de l'inactivation d'une HCP des cellules CHO difficile à retirer, la lipoprotéine lipase a été développée pour améliorer la stabilité du polysorbate dans les formulations d'anticorps monoclonaux.

Surveillance des additifs de fabrication

Une grande variété d'additifs de fabrication doit être surveillée pendant le développement et la fabrication des mAb : détergents, protéine A, réactifs de transfection, antibiotiques, agents antimousse ou facteurs de croissance notamment.

Contrôle microbiologique des mAb

Développer et fabriquer des produits pharmaceutiques conformément aux BPF et à la réglementation nécessitent la mise en place de divers procédures de contrôle microbien. De nombreux mAb sont produits dans des micro-organismes pour bénéficier de leurs vitesses de croissance rapides et de leurs rendements élevés, d'où l'importance de surveiller et de maîtriser la présence des contaminants microbiens. Un constituant de la paroi cellulaire des bactéries à Gram négatif, appelé endotoxine, produit des réactions allant de la fièvre et des frissons jusqu'au choc septique mortel. C'est pourquoi il est crucial de pouvoir détecter les pyrogènes (test d'activation monocytaire [MAT] in vitro) et de pouvoir les éliminer : il s'agit d'ailleurs d'une exigence réglementaire. Les tests de biocharge doivent être utilisés tout au long du procédé de fabrication des mAb pour surveiller la présence de contaminations microbiennes potentiellement nocives. Il est également essentiel de réaliser des contrôles de stérilité pour confirmer l'intégrité de la production des mAb.