Charakterisierung von Biopharmazeutika

Charakterisierung und Analyse von Biologika und Biosimilars

Biologische Arzneimittel erfordern hochentwickelte analytische Arbeitsabläufe für ihre Analyse und Charakterisierung, wobei der Schwerpunkt auf der Einhaltung von GMP und regulatorischen Vorschriften liegt. Die Entwicklung sowohl einer originären biologischen Therapie als auch eines Biosimilars erfordert Studien zur Produktcharakterisierung, um ein robustes und gut spezifiziertes biologisches Arzneimittel zu erhalten.

Identität

Bestimmung der intakten Masse

Die Bestimmung der intakten Molekülmasse, die häufig mit SEC-MS und auf Basis geeigneter Standards durchgeführt wird, ist ein notwendiger Schritt bei der Charakterisierung von Biologika – von der Auswahl der Klone bis zur Überprüfung des Endprodukts. Die Analyse der intakten Molekülmasse wird üblicherweise verwendet, um die Vielfalt der Protein-/Peptidprodukte nachzuweisen und die Identität von Biologika zu überprüfen. Bei entsprechender Optimierung kann sie auch dazu eingesetzt werden, das intakte Molekulargewicht aller Proteinprodukte, einschließlich bispezifischer monoklonaler Antikörper, zu bestimmen.

Alternativ zur schwer zu handhabenden intakten Masse eines großen Biomoleküls wird ein Ansatz zur Proteinverdauungsanalyse verwendet, bei dem die Probe zunächst in wenige Fragmente aufgespalten wird, woraufhin die Separation einzeln mit spezialisierten Massenspektrometrie-Proteomikstandards durchgeführt werden kann.

Titermessung

Die Fähigkeit der Zelllinie, ausreichende Mengen monoklonaler Antikörper zu produzieren, bestimmt ihr wirtschaftliches Potenzial. Als Ausgangsmessung wird der Titer mittels Protein-A-Affinitätschromatographie (HPLC) gemessen. Zu Beginn der Entwicklung eines mAb sollte eine große Anzahl von Erntezellkulturproben (HCC) auf IgG-Titer untersucht werden. Die Affinitätschromatographie mit einem Protein-A-Liganden wird häufig zur Bestimmung der mAb-Konzentration und zur Aufreinigung für die Aggregat- und Ladungsvariantenanalyse im Downstream-Prozess verwendet.

Aminosäureanalyse

Die Aminosäureanalyse ist eine gängige Methode zur Feststellung der Produktidentität und wird zur Bestimmung der Aminosäurezusammensetzung eines mAb eingesetzt. Sie wird häufig zusammen mit einer Messung des Extinktionskoeffizienten durchgeführt, einer Methode, die routinemäßig zur Bestimmung des Titers zwischen verschiedenen Produktionsläufen eingesetzt wird.

Zertifizierte Referenzmaterialien mit Werten, die durch metrologisch gültige Verfahren zugewiesen werden, sind entscheidend für die Minimierung und Kontrolle von Versuchsvariationen in allen Schritten des Arbeitsablaufs der Aminosäureanalyse, einschließlich Proteinextraktion, Fraktionierung, Anreicherung, Proteolyse und Analyse.

Peptidkartierung

Um einen Hinweis auf die Identität des mAb zu erhalten, kann der Vergleich von einfachen Peptidkartierungen einzelner Enzyme ausreichen. Eine detailliertere Charakterisierung therapeutischer Antikörper, einschließlich der N- oder C-terminalen Sequenzierung, der Charakterisierung von Glykanen und anderer Aspekte der Antikörperproduktion, -analyse, -aufreinigung und -fragmentierung kann aussagekräftigere Informationen für die Produktentwicklung liefern. Die Massenspektrometrie in der Proteomik liefert zusätzliche Strukturinformationen.

Posttranslationale Modifikationen

Analyse von N-Glykan

Eine hochgradig variable Glykosylierung kann die Reinheit von mAb beeinträchtigen und zu einer variablen Funktion führen. Monoklonale Antikörper tragen N-Glykane auf ihrem Backbone, die mittels LC-MS freigesetzt werden können, um die Glykosylierungsmuster zu bewerten. Die Charakterisierung der N-Glykane eines monoklonalen Antikörpers ist erforderlich, um vollständige strukturelle Details des untersuchten Moleküls zu erhalten. Das Verständnis dieser N-Glykan-Pfade ist wichtig, da N-Glykane viele Eigenschaften von Glykoproteinen beeinflussen, darunter ihre Konformation, Löslichkeit, Antigenität und Erkennung durch glykanbindende Proteine.

Vergleich monoklonaler Antikörper (mAb) mit Strukturen höherer Ordnung (HOS)

Viele Faktoren beeinflussen HOS – die 3D-Struktur eines mAb – angefangen bei der Wahl der Zelllinie für die mAb-Produktion bis hin zu den Bioprozessbedingungen wie Temperatur, pH-Wert und Lichtexposition. Die Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie (HDX-MS) ist eine Methode, die einen detaillierten Einblick in die Tertiärstruktur des mAb ermöglicht.

Analyse der mAb-Modifikation

Während des mAb-Herstellungsprozesses können viele verschiedene posttranslationale Modifikationen auftreten, die stark von Prozessparametern wie Medien, Temperatur usw. beeinflusst werden. Um ein gleichbleibendes Produkt herzustellen, ist es entscheidend, dass diese Modifikationen bei jedem Durchlauf der mAb-Synthese reproduziert werden. Die Modifikationsanalyse umfasst die Kartierung von Disulfidbrücken und die Bewertung der Glykan-Grundstruktur. Es ist auch ratsam, die Sialylierung zu quantifizieren, da Sialinsäure einen negativen Effekt auf mAb haben kann.

mAb-Ladungsverteilung

Durch posttranslationale Modifikationen (PTM) oder chemische Modifikationen können Ladungsvarianten einen erheblichen Einfluss auf die biologische Aktivität und Pharmakokinetik eines mAb haben. Die Analyse von Ladungsvarianten, die für mAb gesetzlich vorgeschrieben ist, kann mit Methoden wie der Kationenaustauschchromatographie (CEX) und der Kapillar-isoelektrischen Fokussierung (cIEF) durchgeführt werden.

Physikalische Tests und Größenverteilung von mAb

Physikalische Prüfung von mAb

Physikalische Tests dienen der Charakterisierung des Erscheinungsbildes eines mAb und umfassen z. B. die Messung von pH-Wert, Osmolalität und Konzentration. Die Integrität der Verpackung wird ebenfalls im Rahmen des physikalischen Prüfprotokolls bewertet, zum Beispiel die Karl-Fischer-Feuchtigkeitsanalyse oder das Eindringen von Farbstoffen zur Bestätigung der Dichtigkeitsprüfung.

Größenverteilung von HmAb

Es wird zwar ein einheitliches mAb-Produkt angestrebt, doch enthält das ursprüngliche Produktionsmaterial häufig Varianten verschiedener Größe wie Aggregate, Fragmente und Biomoleküle, die zusätzliche leichte Ketten aufweisen. Da diese die Immunogenität und Wirksamkeit beeinträchtigen können, ist es wichtig, ihr Vorhandensein zu überwachen. Die Größenausschlusschromatographie (SEC) ist die am häufigsten verwendete Methode zur Bewertung der Größenverteilung. 

Sterilität & Verunreinigungen

Verunreinigungen durch Wirtszellproteine

Verunreinigungen durch Wirtszellproteine (HCP), die in Biotherapeutika in ppm-Mengen vorhanden sind, stellen ein großes Immunogenitätsrisiko dar, da sie bei Patienten eine unvorhersehbare Immunreaktion auslösen können. Ihre komplexe und vielfältige Natur macht es schwierig, sie zu entdecken oder zu überwachen. Während die meisten HCP-Verunreinigungen in den üblichen Downstream-Aufreinigungsverfahren wirksam entfernt werden können, stellen einige wenige HCP eine besondere Herausforderung dar. Knockouts eines schwer zu entfernenden CHO-HCP, der Lipoproteinlipase, wurden entwickelt, um die Stabilität von Polysorbaten in monoklonalen Antikörperformulierungen zu verbessern.

Überwachung von Herstellungszusätzen

Während der Entwicklung und Herstellung von mAb muss eine Vielzahl von Herstellungszusätzen überwacht werden, darunter Detergenzien, Protein A, Transfektionsreagenzien, Antibiotika, Entschäumer und Wachstumsfaktoren.

Mikrobielle Prüfung von mAb

Für die GMP-konforme Entwicklung und Herstellung von Arzneimitteln ist eine Vielzahl von mikrobiologischen Prüfverfahren erforderlich. Viele mAb werden in Mikroorganismen hergestellt, um sich deren hohe Wachstumsraten und Ausbeuten zunutze zu machen. Aus diesem Grund ist das Monitoring und die Kontrolle mikrobieller Verunreinigungen von entscheidender Bedeutung. Ein Bestandteil der Zellwand gramnegativer Bakterien, das sogenannte Endotoxin, ruft Reaktionen hervor, die von Fieber und Schüttelfrost bis hin zu einem tödlichen septischen Schock reichen. Daher sind der Nachweis von Pyrogenen (MAT-In-vitro-Tests) und deren anschließende Entfernung aus dem mAb essenziell und auch gesetzlich vorgeschrieben. Keimbelastungsprüfungen sollten während des gesamten mAb-Herstellungsprozesses durchgeführt werden, um zu überwachen, ob eine potenziell schädliche mikrobielle Kontamination vorliegt. Sterilitätsprüfungen sind ebenfalls wichtig, um die Integrität der mAb-Produktion zu bestätigen.