Immunhistochemie
Immunhistochemie (IHC) und Immunfluoreszenz (IF) als Nachweismethoden
Die Immunhistochemie (IHC) ist eine biochemische Methode, bei der Antikörper eingesetzt werden, die an spezifische Antigene in einem Gewebeschnitt binden. Ähnlich eignet sich die Immunzytochemie (ICC) zur Identifizierung von Antigenen in einzelnen Zellschichten. Die IHC wird verbreitet zur Visualisierung der gesuchten Proteine, Kohlenhydrate und Lipide sowohl in gesundem als auch krankem Gewebe wie Karzinomen eingesetzt. Spezifische molekulare Marker sind charakteristisch für zelluläre Ereignisse wie Proliferation oder Zelltod (Apoptose). Die IHC wird außerdem häufig in der Grundlagenforschung für ein besseres Verständnis der Verteilung und Lokalisierung von Biomarkern und differenziell exprimierten Proteinen in unterschiedlichen Teilen biologischer Gewebe eingesetzt.
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Gewebevorbereitung, Antigenrückgewinnung und -vorbehandlung für die IHC
Typischerweise wird Gewebe fixiert, in Paraffin eingebettet und mit einem Mikrotom für die IHC-Analyse geschnitten. Ein wichtiger Schritt nach der initialen Gewebevorbereitung ist die Antigenrückgewinnung. Sie ist erforderlich, um bei der Fixierung gebildete Proteinverkettungen aufzubrechen und maskierte Antigenbindungsstellen freizulegen. Die Bedingungen für die Antigenrückgewinnung und -vorbehandlung müssen empirisch bestimmt werden, da die Zugänglichkeit des Antigenepitops abhängig von zahlreichen biologischen Faktoren stark variieren kann. Beispielsweise erfordern einige Antigene ggf. eine aggressivere Vorbehandlung, um ihre Antikörperbindungsepitope zu demaskieren, während andere Antigene möglicherweise überhaupt keine Vorbehandlung erfordern. Es gibt zwei gebräuchliche Methoden der Antigenrückgewinnung. Die erste ist die Hitze-induzierte Epitoprückgewinnung (HIER), bei der eine Heizquelle in Verbindung mit Puffern und Enzymen (Proteinase K) verwendet wird. Die zweite Methode ist die Protease-induzierte Epitoprückgewinnung (PIER), bei der verschiedene Proteasen wie Proteinase K, Trypsin, Chymotrypsin oder Pepsin eingesetzt werden.
IHC-Färbung und -Nachweis
Nach der Gewebevorbereitung und Antigenrückgewinnung kann die Antikörper-Antigen-Interaktion auf verschiedene Weise visualisiert werden. Eine gebräuchliche Methode verwendet einen Primärantikörper, der an ein Enzym wie Meerrettichperoxidase oder alkalische Phosphatase konjugiert ist und eine farberzeugende Reaktion katalysiert. Alternativ dazu nutzt die Immunfluoreszenz (IF)-Methode einen Antikörper, der mit einem Fluorophor wie Fluorescein, Rhodamin oder Alexa Fluor markiert ist. Eine weitere Option ist die Verwendung eines unmarkierten Primärantikörpers und ein indirekter Antigennachweis durch einen markierten Sekundärantikörper oder komplexere Nachweissysteme. In diesem Fall sollte der optimale Titer sowohl für den primären als auch den sekundären Antikörper für jeden Assay bestimmt werden.
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