Protein-Pulldown-Techniken

Affinitäts-GST-Pulldown-Anwendungen

Glutathion-S-Transferase (GST) ist ein Protein aus 211 Aminosäuren, das in den meisten Organismen vorkommt. GST wird häufig in Expressionsvektoren integriert, um die Fusionsmarke innerhalb von E. coli-Proteinexpressionssystemen zu erzeugen. Das GST-Tag ist ein großes Protein-Tag mit einer Größe von etwa 26 kDa und kann in Bakterien-, Hefe-, Säugetier- und Insektenzellen exprimiert werden. Das GST-Tag ist von Vorteil, wenn das rekombinante Protein vor intrazellulärer Proteasespaltung geschützt werden muss und wenn die Löslichkeit des markierten Proteins verbessert werden soll. Darüber hinaus bietet das GST-Protein ein Hochaffinitätstag für eine einfache Aufreinigung und für Pulldown-Experimente mit kostengünstigen Affinitätsharzen, die unter milden Elutionsbedingungen durchgeführt werden.

Co-Immunpräzipitation

Der Pulldown-Assay ist ideal zur Überprüfung von Co-Immunpräzipitationsergebnissen und eine ausgezeichnete Methode zur Identifizierung unbekannter Protein-Protein-Interaktionen zusammen mit dem Aktivierungsstatus spezifischer Proteine. Im Gegensatz zu Affinitäts-Pulldown-Methoden werden bei der IP Antikörper eingesetzt, um an Antigene aus komplexen biologischen Proben zu binden und diese zu isolieren. 

Co-IP bezieht sich auf die Verwendung eines Antikörpers, um ein Antigen innerhalb eines Multiproteinkomplexes zu binden. Der Komplex wird dann mit der Zugabe von Protein A- oder Protein G-Medium eingefangen. Die hohe Affinität von Protein A/G zum Fc-Teil polyklonaler und monoklonaler Antikörper vom Typ IgG macht sie zu einer kritischen Komponente bei der Aufreinigung des Zielproteins oder Proteinkomplexes. Der Einsatz von Protein-Pulldown-Methoden stellt ein wichtiges Werkzeug für die Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionsnetzwerken dar. Die Wahl der spezifischen Methode wird dabei durch den spezifischen Anwendungsbedarf des Wissenschaftlers bestimmt.