Saggi per la determinazione dell’attività enzimatica

Determinazione delle condizioni ottimali per l'attività enzimatica

Sebbene in letteratura siano descritti numerosi saggi enzimatici, le procedure utilizzate vanno comunque sempre ottimizzate in relazione ai requisiti specifici dell'enzima in esame. L'attività specifica di un enzima dipende da numerosi fattori tra cui pH, temperatura, forza ionica oltre che dalla concentrazione di tutti i componenti del saggio. Per parametri come il pH, l'attività enzimatica spesso segue a una curva a campana. In corrispondenza di un pH specifico l’attività enzimatica risulta massima (V_max), mentre va decrescendo via via ci si avvicina alle due estremità della curva. Alcuni enzimi possono richiedere considerazioni aggiuntive riguardo ai composti non direttamente coinvolti nella reazione, come ioni metallici, detergenti e molecole idrofobe.

Determinazione delle condizioni ottimali per l'attività enzimatica

Sebbene in letteratura siano descritti numerosi saggi enzimatici, le procedure utilizzate vanno comunque sempre ottimizzate in relazione ai requisiti specifici dell'enzima in esame. L'attività specifica di un enzima dipende da numerosi fattori tra cui pH, temperatura, forza ionica oltre che dalla concentrazione di tutti i componenti del saggio. Per parametri come il pH, l'attività enzimatica spesso segue a una curva a campana. In corrispondenza di un pH specifico l’attività enzimatica risulta massima (V_max), mentre va decrescendo via via ci si avvicina alle due estremità della curva. Alcuni enzimi possono richiedere considerazioni aggiuntive riguardo ai composti non direttamente coinvolti nella reazione, come ioni metallici, detergenti e molecole idrofobe.

Componenti del dosaggio enzimatico

L’acqua costituisce il solvente standard per moltissimi enzimi; del resto, l’ambiente cellulare è acquoso. Tuttavia, nel caso di enzimi o componenti enzimatici insolubili in acqua si ricorre a solventi organici. Anche i substrati e i cofattori, rivestendo un importante ruolo nell’attività catalitica dell’enzima, rappresentano dei componenti critici di cui tener conto nei saggi di attività enzimatica. Essi vengono spesso identificati in base alla loro funzione in condizioni fisiologiche, là dove I’interazione con specifici substrati e cofattori risulti necessaria all’attività di una vasta gamma di enzimi. Altri elementi critici da considerare sono i tamponi e gli ioni che, essendo essenziali per stabilizzare il pH durante il saggio, sono in grado di influenzare direttamente l'attività enzimatica. Ad esempio, ioni metallici mono o bivalenti possono essere necessari per l'attività catalitica dei cofattori e, quindi, anche per l'attività enzimatica.

Esecuzione di un saggio enzimatico

Il primo passaggio per la preparazione di un saggio enzimatico consiste nella preparazione di una miscela contenente i diversi componenti. Per evitare gli errori di pipettaggio che sono inevitabili quando si trattano piccoli volumi, in generale è preferibile preparare un grande volume di miscela, escludendo però un componente attivante. Una volta preparata la miscela, il ricercatore aggiungerà il componente attivante che darà inizio al saggio. Prima che il saggio abbia inizio, si provvede al pretrattamento dell’enzima che consiste nella conservazione a basse temperature e, spesso, nell’aggiunta di vari additivi chimici o proteici. Questo garantisce la stabilità e la massima enzimatica per il saggio pianificato. Una volta aggiunti tutti i componenti, è necessario miscelare rapidamente e accuratamente per dare inizio della reazione. La registrazione dei dati deve iniziare immediatamente dopo la miscelazione e il segnale rilevabile deve venire riportato graficamente per l'intera durata della reazione.