Citometria a flusso

Anticorpi e marcatori per citometria a flusso

Un'analisi in citometria a flusso richiede l'impiego di diversi anticorpi e marcatori per citometria. Nella citometria a flusso, gli anticorpi si legano in maniera specifica a diversi marcatori cellulari, contribuendo a caratterizzare le cellule e a valutare eventuali mutazioni dell'espressione proteica nell'ambito dell'esperimento. Per la visualizzazione degli anticorpi in applicazioni di citometria a flusso sono disponibili numerosi marcatori, tra i quali coloranti per gli acidi nucleici, coloranti per l’analisi della vitalità cellulare, coloranti polimerici, punti quantici, piccole molecole organiche e proteine fluorescenti. Gli anticorpi sono normalmente marcati tramite coniugazione diretta (in commercio sono disponibili sia anticorpi coniugati, sia kit di coniugazione che consentono all'utente finale di effettuare la coniugazione) o grazie all'impiego di un anticorpo secondario. 

Applicazioni della citometria a flusso

La citometria a flusso viene utilizzata in numerosi settori, spesso per analisi multiparametriche in diverse popolazioni di cellule. Le applicazioni più comuni nel campo della biologia molecolare includono l'analisi di proteine ricombinanti fluorescenti la cui espressione viene indotta in vari tipi cellulari per la comprensione della funzione genica o per analisi di cell tracking in vivo. La colorazione del DNA consente l'analisi del ciclo cellulare, mentre l'uso di anticorpi rende possibili un'ampia gamma di studi come quelli di trasduzione del segnale, RNA ed espressione proteica. Una delle applicazioni più comuni della citometria a flusso è l’immunofenotipizzazione. Nella immunofenotipizzazione, degli anticorpi coniugati con un fluorocromo riconoscono più antigeni sulla superficie delle cellule consentendo l'identificazione di cellule immunitarie specifiche all'interno di una popolazione.

Analisi dei dati nella citometria a flusso

L'analisi dei dati nella citometria a flusso spesso comporta l'identificazione di una regione specifica o di un gruppo (cluster) di cellule; una volta identificato un gruppo di interesse, si applicano parametri sperimentali aggiuntivi per indagini più dettagliate, ad esempio si ricercano ulteriori fattori di identificazione per ottenere maggiori informazioni sull'identità cellulare. Numerosi sono i programmi di software che vengono usati per facilitare questo tipo di analisi e per altre analisi del ciclo cellulare.

Strumenti per citometria a flusso

I componenti principali di un citometro a flusso (o citofluorimetro) sono il sistema elettronico, il sistema ottico e il sistema fluidico. La fluidica funge da sistema di erogazione del liquido per indirizzare il campione ai componenti ottici, costituiti dall'ottica di eccitazione (laser) e dall'ottica di raccolta, cioè fotodiodi e tubi fotomoltiplicatori (PMT). I componenti elettronici convertono le informazioni dei sensori in segnali digitali che vengono interpretati dai computer. Per analisi più avanzate dei campioni, è possibile combinare al citofluorimetro sistemi aggiuntivi, per esempio cell sorter, che consentono di selezionare, purificare e raccogliere campioni, e citometri per immagini che combinano la citometria a flusso con la microscopia a fluorescenza.