Pull-down di proteine

Applicazioni del pull-down per affinità con GST

La glutatione S-transferasi (GST) è una proteina di 211 amminoacidi che si trova nella maggior parte degli organismi. La GST viene spesso inserita nei vettori di espressione ai fini della produzione di proteine di fusione con tag GST in sistemi di espressione come gli E. coli. Il tag-GST è un tag proteico di grandi dimensioni, circa 26 kDa, e può essere espresso in cellule di batteri, lieviti, mammiferi e insetti. L’uso di un tag GST è vantaggioso quando è necessario proteggere la proteina ricombinante dall’azione delle proteasi intracellulari o aumentarne la solubilità. Inoltre, la proteina-GST include un tag ad alta affinità che agevola la purificazione e gli esperimenti di pull-down con l'impiego di resine di affinità poco costose in condizioni di eluizione blande.

Co-immunoprecipitazione

Il saggio di pull-down è ideale per verificare i risultati della co-immunoprecipitazione ed è un metodo eccellente per identificare interazioni proteina-proteina sconosciute oltre che lo stato di attivazione di determinate proteine. A differenza dei metodi di pull-down basati sull’affinità, l'IP si avvale di anticorpi per legare e isolare gli antigeni da campioni biologici complessi. 

Nella Co-IP, un anticorpo lega un antigene all'interno di un complesso multiproteico. Il complesso viene quindi catturato con l'aggiunta di proteina A o proteina G legate a un supporto. L'elevata affinità delle proteine A/G per la regione Fc degli anticorpi IgG policlonali e monoclonali le rende un componente critico nella purificazione di proteine o di complessi proteici di interesse. Il metodo del pull-down costituisce uno strumento essenziale per lo studio delle reti di interazione proteina-proteina; tuttavia, la scelta del metodo specifico sarà determinata dalla specifica esigenza applicativa del ricercatore.