Purificazione delle proteine

Fattori critici per la purificazione delle proteine

La struttura e la funzione delle proteine sono spesso fattori critici di cui tener conto nella scelta della strategia di purificazione più opportuna. L'attività biochimica o biologica di una proteina ricombinante è parzialmente determinata da domini discreti all'interno della proteina stessa, che dipendono, in buona parte, dal ripiegamento della proteina nelle sue strutture secondaria, terziaria e quaternaria. 

Il ripiegamento delle proteine, che viene complessivamente definito struttura di ordine superiore (HOS), è essenziale perché la la proteina assuma la sua forma tridimensionale corretta e perché possa esplicare la sua funzione. Un’altra caratteristica molto importante per la purificazione di una proteina è data dalla sua solubilità che è influenzata da numerosi fattori tra cui la dimensione globale e gli elementi presenti in corrispondenza delle estremità N e C-terminale. Comunemente, le proteine ricombinanti incorporano in posizione N- e C-terminale delle etichette (tag), cioè piccole sequenze utilizzate per la rivelazione e la purificazione con procedure immunoistochimiche o cromatografia di affinità, a seconda del tipo di etichetta e delle applicazioni previste successivamente.

Metodiche di purificazione delle proteine e relative applicazioni

I ricercatori hanno oggi a disposizione numerose metodiche, reagenti e strumenti per la purificazione delle proteine, sia che intendano studiarne la funzione o che cerchino di incrementarne i volumi di purificazione usando strategie su scala industriale per produzioni biotecnologiche e farmaceutiche. La metodica di purificazione prescelta determinerà in parte il flusso di lavoro per la preparazione del campione. La cromatografia di affinità rappresenta una fase di purificazione iniziale adatta per le proteine​ricombinanti solubilizzate che contengano le tag opportune; spesso succede però che si leghino alla colonna anche proteine indesiderate e che eluiscano nel lavaggio finale insieme alla proteina di interesse. Se è necessario si ricorre quindi a un'ulteriore fase di purificazione utilizzando strategie di purificazione supplementari che includono la cromatografia di esclusione dimensionale o la cromatografia a scambio ionico. È importante sottolineare che, nel caso in cui i ricercatori vogliano eliminare dalla proteina finale purificata qualsiasi sequenza non nativa, molte delle etichette di affinità possono essere rimosse.