Funkcjonalna genomika przesiewowa

Postępy w edycji genów, wyciszaniu genów, modulacji genów, sekwencjonowaniu następnej generacji (NGS) i fenotypowych technologiach przesiewowych umożliwiają wydajne wykonywanie funkcjonalnych ekranów genomowych w szerokiej gamie systemów modelowych.

• Interferencja RNA (RNAi): Do wyciszania genów można stosować kilka rodzajów odczynników RNAi, w tym długie dwuniciowe RNA (dsRNA), syntetyczne małe interferujące RNA (siRNA) i krótkie RNA ze spinką do włosów (shRNA). Te odczynniki RNAi są wprowadzane do komórek poprzez bezpośrednią transfekcję czynnika modulującego (siRNA i dsRNA), poprzez transfekcję DNA kodującego shRNA napędzane promotorem lub metodami transdukcji wirusowej przy użyciu konstruktów lentiwirusowych ze sklonowanymi kasetami shRNA. dsRNA i siRNA mogą być stosowane w ekranach tablicowych do badań przesiewowych o wysokiej przepustowości, podczas gdy shRNA mogą być wprowadzane do populacji komórek w ekranach tablicowych lub zbiorczych do analizy o wysokiej przepustowości, z ekranami zbiorczymi wykorzystującymi sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) do dekonwolucji.
• Systemy CRISPR-Cas: Systemy CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeat) mogą być wykorzystywane do manipulowania genomami, transkryptomami i epigenomami komórek ssaków. W edycji genów CRISPR-Cas9 nukleaza Cas9 jest kierowana do określonego miejsca za pomocą RNA prowadzącego. W zależności od zastosowanego wariantu Cas9, CRISPR może być wykorzystywany do genetycznego wyciszania produkcji transkryptów poprzez wprowadzanie mutacji z przesunięciem ramki, represję maszyn transkrypcyjnych, rekrutację czynników transkrypcyjnych w celu aktywacji ekspresji, indukowanie ukierunkowanych mutacji punktowych lub modyfikowanie markerów epigenetycznych. Podobnie jak w przypadku RNAi, CRISPR może być wprowadzany bezpośrednio jako kompleks RNP w badaniach przesiewowych lub jako plazmidowe DNA lub lentiwirus do zastosowań zarówno w badaniach zbiorczych, jak i przesiewowych. Pule, biblioteki i tablice CRISPR ułatwiają wyjątkowo wszechstronne, wysokoprzepustowe badania przesiewowe genów do analizy funkcjonalnej. Badania przesiewowe z modulacją genomu są również możliwe dzięki beznukleazowemu systemowi CRISPR, który wykorzystuje enzymatycznie nieaktywny dCas9 w połączeniu z efektorami transkrypcji, które aktywują (CRISPRa) lub hamują (CRISPRi) transkrypcję genów, prowadząc do zwiększenia lub zmniejszenia ekspresji genów.