Ekspresja białek

Wektory ekspresji białek

Wektory ekspresji lub plazmidy to koliste sekwencje DNA, które są powszechnie używane przez naukowców jako narzędzie do hostowania genu kodującego interesujące ich białko. Plazmidy zawierające interesujący gen są następnie transformowane lub transfekowane do komórek w celu nadekspresji białka. Plazmidy zawierają różne przydatne elementy, które ułatwiają klonowanie, selekcję klonów, ekspresję i oczyszczanie białek, w tym między innymi wielokrotne miejsce klonowania (MCS), geny oporności na antybiotyki używane do selekcji klonów, unikalne znaczniki do identyfikacji i oczyszczania białek oraz silne regiony promotorowe do napędzania ekspresji białek. Istnieje szeroka gama wektorów do ekspresji białek, ponieważ wiele z tych elementów jest wymiennych w zależności od konkretnych potrzeb aplikacji i typu komórek używanych do ekspresji białek.

Bakteryjne, ssaków i dodatkowe systemy ekspresji białek

Dzięki szybkiej kinetyce wzrostu i transformacji plazmidów w E. coli w ciągu zaledwie kilku minut, bakterie są organizmem roboczym do produkcji białek rekombinowanych. Ekspresja białek bakteryjnych opiera się na podjednostkach rybosomalnych 30S i 50S rybosomu bakteryjnego 70S. Aby zapobiec wzrostowi komórek wolnych od plazmidów, plazmidy zawierające geny odporne na antybiotyki są stosowane jako metoda selekcji w celu identyfikacji i izolacji bakterii, które włączyły plazmidy zawierające sekwencję kodującą białko będące przedmiotem zainteresowania. Podczas gdy dodatkowe sekwencjonowanie genetyczne jest często konieczne do potwierdzenia obecności sekwencji genu, liczne antybiotyki blokujące syntezę białek bakteryjnych są powszechnie stosowane do usuwania bakterii wolnych od plazmidów. Oprócz bakterii, linie komórkowe owadów, drożdży i ssaków są również powszechnie wykorzystywane do ekspresji białek. Jednakże, w przeciwieństwie do bakterii, eukariotyczne linie komórkowe zawierają dodatkową maszynerię molekularną do generowania modyfikacji potranslacyjnych (np. glikozylacji) i są często niezbędne dla funkcjonalności białka i znaczących dalszych analiz.

Zastosowania do ekspresji białek rekombinowanych

Białka rekombinowane to białka, które są kodowane w plazmidzie wyrażającym białko i zostały zmodyfikowane w celu maksymalnej ekspresji/oczyszczania białka lub zmutowane w celu oceny funkcji białka. Zdolność do dodawania, usuwania lub zmiany sekwencji kodującej białko, nawet o jeden nukleotyd, zapewnia naukowcom niezwykle potężne narzędzie do badania wielu różnych podstawowych pytań badawczych i wyjaśnienia funkcji białka zarówno w zdrowych, jak i chorych tkankach. Implikacje technologii ekspresji białek rekombinowanych wykraczają daleko poza podstawowe zastosowania badawcze i mają zasadnicze znaczenie dla rozwoju ratujących życie terapii i szczepionek.