Protokół hodowli ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)

Przechowywanie komórek HUVEC
Przygotowanie kultury
Kultura HUVEC
Subculturing HUVEC
Materials

Przechowywanie komórek HUVEC

A. Fiolki kriokonserwowane (200-05n, 200p-05n, S200-05n)

Przechowywać fiolki kriokonserwowane w zbiorniku z ciekłym azotem natychmiast po ich dostarczeniu.

*Podczas wyjmowania fiolek kriokonserwowanych ze zbiornika z ciekłym azotem należy nosić maseczkę ochronną i rękawiczki. Gwałtowna zmiana temperatury między zbiornikiem a pomieszczeniem może spowodować pęknięcie uwięzionego w fiolkach ciekłego azotu i obrażenia.

Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)

Kultura Przygotowanie 

1. Upewnij się, że szafa bezpieczeństwa biologicznego klasy II, z laminarnym przepływem powietrza filtrowanym HEPA, jest w odpowiednim stanie technicznym.
2. Sterylizuj szafkę bezpieczeństwa biologicznego 70% alkoholem.
3. Włącz dmuchawę szafki bezpieczeństwa biologicznego na 10 minut przed rozpoczęciem pracy z kulturami komórkowymi.
4. Upewnij się, że wszystkie pipety serologiczne, końcówki do pipet i roztwory odczynników są sterylne.
5. Przestrzegać standardowej techniki sterylizacji i zasad bezpieczeństwa:
   a.    Nie pipetować doustnie.
   b.Zawsze noś rękawice i okulary ochronne podczas pracy z ludzkimi komórkami, nawet jeśli wszystkie szczepy zostały przebadane na obecność wirusa HIV, zapalenia wątroby typu B i zapalenia wątroby typu C.
   c.    Wszystkie prace związane z hodowlą komórek należy wykonywać w sterylnym pomieszczeniu.

Kultura HUVEC

A. Przygotowanie kolb do hodowli komórek HUVEC

1. Pobierz Podłoże do wzrostu komórek śródbłonka  (211-500) z lodówki. Odkazić butelkę 70% alkoholem w sterylnym kapturze.
2. Odmierzyć pipetą 20 ml Podłoża do wzrostu komórek śródbłonka (211-500)* do kolby T-75  (SIAL0641).
   * Stosunek pożywki do powierzchni powinien wynosić 1 ml na 5 cm².
   Na przykład:
   -  5 mL dla kolby T-25 (SIAL0639) lub naczynia do hodowli tkanek o średnicy 60 mm (SIAL0166).
   -  15 ml dla kolby T-75  (SIAL0641) lub 100 mm naczynie do hodowli tkankowej  (SIAL0167).

B. Rozmrażanie i płytkowanie HUVEC

1. Wyjmij kriokonserwowaną fiolkę HUVEC ze zbiornika do przechowywania ciekłego azotu, stosując odpowiednią ochronę oczu i rąk.
2. Obróć nakrętkę fiolki o ćwierć obrotu, aby uwolnić ciekły azot, który może być uwięziony w gwintach, a następnie ponownie dokręć nakrętkę.
3. Szybko rozmroź komórki, umieszczając dolną połowę fiolki w łaźni wodnej o temperaturze 37°C i uważnie obserwuj fiolkę podczas procesu rozmrażania.
4. Wyjmij fiolkę z łaźni wodnej, gdy w fiolce pozostanie tylko niewielka ilość lodu.Nie dopuścić do całkowitego rozmrożenia komórek.
5. Odkazić zewnętrzną powierzchnię fiolki 70% alkoholem w sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego.
6. Ostrożnie zdjąć korek fiolki. Nie dotykaj brzegu nakrętki ani fiolki rękami, aby uniknąć zanieczyszczenia.
7. Zawieś ponownie komórki w fiolce, delikatnie pipetując komórki 5 razy pipetą o pojemności 2 ml. Uważaj, aby nie pipetować zbyt energicznie, aby nie spowodować pienienia.
8. Przeprowadź pipetą zawiesinę komórek (1 ml) z fiolki do kolby T-75 (SIAL0641) zawierającej 20 mL pożywki do wzrostu komórek śródbłonka  (211-500).
9. Zamknij kolbę i delikatnie wstrząśnij, aby równomiernie rozprowadzić komórki.
10. Umieść kolbę T-75  (SIAL0641) w 37 ^oC, 5% CO₂ nawilżanym inkubatorze. Poluzuj pokrywę, aby umożliwić wymianę gazową. Aby uzyskać najlepsze wyniki, nie należy zakłócać hodowli przez 24 godziny po zaszczepieniu.
11. Zmień na świeżą pożywkę Endothelial Cell Growth Medium  (211-500) po 24 godzinach lub na noc, aby usunąć wszystkie ślady DMSO.
12. Zmieniaj pożywkę Endothelial Cell Growth Medium  (211-500) co drugi dzień, aż komórki osiągną 60% konfluencji.
13. Podwoić objętość pożywki Endothelial Cell Growth Medium (211-500), gdy hodowla osiągnie 60% konfluencji lub w przypadku karmienia weekendowego.
14. Poddaj komórki subkulturze, gdy hodowla HUVEC osiągnie 80% konfluencji.

Podhodowla HUVEC

A. Przygotuj odczynniki do subkultury

1. Wyjmij Roztwór trypsyny-EDTA  (T3924) i Inhibitor trypsyny  (T6414) z zamrażarki -20 °C i rozmroź przez noc w lodówce.
2. Upewnij się, że wszystkie odczynniki do podhodowli są rozmrożone. Delikatnie zawiruj każdą butelkę kilka razy, aby utworzyć jednorodne roztwory.
3. Przechowuj wszystkie odczynniki do podhodowli w temperaturze 4 °C do wykorzystania w przyszłości.
4. Aliquot Trypsin/EDTA solution (T3924) i przechowuj niewykorzystaną część w temperaturze -20 °C, jeśli potrzebna jest tylko część Trypsin/EDTA (T3924).

B. Przygotuj kolbę hodowlaną

1. Pobierz pożywkę do hodowli komórek śródbłonka.Endothelial Cell Growth Medium  (211-500) z lodówki. Odkazić butelkę 70% alkoholem w sterylnym kapturze.
2. Odmierzyć pipetą 30 ml pożywki do wzrostu komórek śródbłonka (Endothelial Cell Growth Medium (211-500) do kolby T-175 (SIAL1080) (do użycia w sekcji IV C, krok 15).)

C. Subkultura HUVEC

Trypsynuj komórki w temperaturze pokojowej. Nie podgrzewać żadnych odczynników do temperatury 37 °C.

1. Usuń pożywkę z kolb hodowlanych przez aspirację.
2. Umyj monowarstwę komórek za pomocą HBSS (H6648) i usuń roztwór przez aspirację.
3. Dozuj pipetą 5 ml roztworu trypsyny/EDTA (T3924) do kolby T-75  (kolby T-75). Delikatnie potrząśnij kolbą, aby upewnić się, że roztwór pokrywa wszystkie komórki.
4. Natychmiast usuń 4,5 ml roztworu.
5. Zamknij szczelnie kolbę i monitoruj postęp trypsynizacji w temperaturze pokojowej pod odwróconym mikroskopem. Zazwyczaj potrzeba około 1 minuty, aby komórki stały się zaokrąglone.
6. Uwolnij zaokrąglone komórki z powierzchni hodowli, uderzając bokiem kolby o dłoń, aż większość komórek zostanie odłączona.
7. Odmierzyć pipetą 5 ml roztworu inhibitora trypsyny (T6414) do kolby, aby zahamować dalszą aktywność tryptyczną.
8. Przenieść zawiesinę komórek z kolby do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
9. Przepłucz kolbę dodatkowymi 5 ml roztworu inhibitora trypsyny (T6414) i przenieś roztwór do tej samej probówki stożkowej.
10. Zbadaj kolbę T-75  (SIAL0641) pod mikroskopem. Jeśli w kolbie pozostało >20% komórek, powtórz kroki 2-9.
11. Wiruj probówkę stożkową z prędkością 220 x g przez 5 minut, aby osuszyć komórki.
12. Spuść supernatant z probówki bez naruszania osadu komórek.
13. Przesuń palcem końcówkę probówki stożkowej, aby poluzować osad komórek.
14. Zawieś ponownie komórki w 2 ml Podłoża do wzrostu komórek śródbłonka  (211-500) delikatnie pipetując komórki w celu rozbicia grudek.
15. Przelicz komórki za pomocą hemocytometru lub licznika komórek. Zaszczepić 10 000 komórek na cm² dla szybkiego wzrostu lub 5 000 komórek na cm² dla regularnych subkultur.

.