HPLC dużych cząsteczek

HPLC z odwróconymi fazami biomolekuł

HPLC z odwróconymi fazami (RP-HPLC) to czuła i wszechstronna technika stosowana do rozdzielania i analizy białek, fragmentów białek i peptydów. RP-HPLC wykorzystuje niepolarną fazę stacjonarną i polarną fazę ruchomą. Retencja białek i peptydów na fazie stacjonarnej odbywa się zgodnie z zasadami adsorpcji i podziału. Hydrofobowe regiony białka odwracalnie przyłączają się do fazy stacjonarnej. Białka są eluowane poprzez zwiększenie niepolarnego charakteru fazy ruchomej. Na rozdzielczość może wpływać wielkość porów, wielkość cząstek, długość kolumny i łańcuch węglowodorowy przyłączony do fazy stacjonarnej.

Chromatografia wykluczania wielkości (SEC)

Chromatografia wykluczania wielkości (SEC) to tryb chromatografii bez denaturacji, który rozdziela cząsteczki według ich wielkości (tj. promienia hydrodynamicznego). Tryb ten nie opiera się na interakcji analitu z fazą stacjonarną, ale raczej na losowym przepływie analitu przez cząsteczki fazy stacjonarnej. Anality o wysokiej masie cząsteczkowej eluują wcześniej, ponieważ są całkowicie lub częściowo wykluczone z porów cząstek fazy stacjonarnej, podczas gdy anality o niższej masie cząsteczkowej eluują później, ponieważ spędzają więcej czasu na pokonywaniu trudnej ścieżki przez cząstkę. SEC został wykorzystany do scharakteryzowania agregatów i fragmentów przeciwciał monoklonalnych (mAbs), oszacowania nieznanych mas cząsteczkowych białek i określenia stabilności preparatów białkowych.

Chromatografia oddziaływań hydrofobowych (HIC)

Chromatografia oddziaływań hydrofobowych (HIC) to tryb chromatografii, który oddziela anality na podstawie stopnia interakcji między hydrofobowymi cząsteczkami analitu a hydrofobowymi ligandami fazy stacjonarnej. Ze względu na niższą masę cząsteczkową i mniejszą skłonność do fałdowania, HIC zwykle nie jest stosowana do separacji peptydów. W przypadku wysokich stężeń soli, warstwy hydratacyjne białek mogą zostać zakłócone na tyle, aby hydrofobowe obszary powierzchniowe mogły połączyć się z niepolarną fazą stacjonarną. Wybór soli jest podyktowany serią Hofmeistera, która klasyfikuje kationy i aniony według ich zdolności do zakłócania warstw hydratacyjnych białek (chaotropowe) lub promowania tworzenia warstw hydratacyjnych białek (kosmotropowe). Typowe sole obejmują siarczan amonu, siarczan potasu i siarczan sodu. Chromatografia oddziaływań hydrofobowych jest obecnie wykorzystywana do określania profilu stosunku leku do przeciwciała (DAR) koniugatów przeciwciało-lek (ADC).

Chromatografia jonowymienna (IEX)

Chromatografia jonowymienna (IEX) to sposób chromatografii, który rozdziela anality według ładunku. Białka i peptydy są amfoteryczne, co oznacza, że wykazują zarówno funkcje kwasowe, jak i zasadowe. Kwaśne funkcje białek obejmują kwas asparaginowy, kwas glutaminowy, cysteinę, tyrozynę i α-karboksylan C-końca. Podstawowe funkcje białek obejmują argininę, histydynę, lizynę i α-aminę na N-końcu. Warianty ładunku bioterapeutycznego mogą być wykrywane i rozwiązywane przez IEX. Warianty ładunku mogą wynikać z błędnej translacji transkryptu informacyjnego RNA (mRNA) i/lub modyfikacji potranslacyjnych, takich jak deamidacja, utlenianie lub glikozylacja.

Kolumna IEX musi być wybrana w oparciu o punkt izoelektryczny analitu (pI). Jeśli pH fazy ruchomej jest niższe niż pI, analit będzie naładowany dodatnio i zwiąże się z kolumną kationowymienną.Jeśli pH fazy ruchomej jest powyżej pI, analit będzie naładowany ujemnie i zwiąże się z kolumną anionowymienną.

Chromatografia powinowactwa

Chromatografia powinowactwa opiera się na specyficznej interakcji między analitem a ligandem fazy stacjonarnej. W idealnym przypadku tylko interesujący analit łączy się z fazą stacjonarną, pozwalając wszystkim innym składnikom próbki przejść przez kolumnę. Druga faza ruchoma jest następnie przepuszczana przez kolumnę w celu elucji analitu.

Chromatografia białka A jest najczęstszą formą chromatografii powinowactwa stosowaną w przemyśle biofarmaceutycznym. Białko A jest białkiem powierzchniowym o masie 42 kDa występującym w ścianie komórkowej S. aureus.Białko to wiąże się specyficznie z łańcuchem ciężkim w regionie Fc IgG, dzięki czemu jest to idealny mechanizm do oddzielania IgG od innych składników próbki. Większość kolumn z białkiem A jest wytwarzana poprzez unieruchomienie białka na porowatej, organicznej cząsteczce. Jednak wyprodukowano monolityczny format do chromatografii białka A, pozwalający na wysoką przepustowość próbki przy różnych prędkościach przepływu, bez poświęcania wydajności.