Zestaw do immunoprecypitacji (białko G) Protokół i rozwiązywanie problemów

 

IMMUNOPRECYPCJA Z WYKORZYSTANIEM IMMOBILIZOWANEJ PROTEINY G

Immunoprecypitacja służy do analizy docelowych antygenów w złożonej mieszaninie białek. Interesujące białko może być zatężone i oczyszczone w jednym etapie w skali analitycznej za pomocą specyficznego przeciwciała. Często immunoprecypitowane białka są funkcjonalnie aktywne i mogą być dalej analizowane pod kątem aktywności enzymatycznej, interakcji, modyfikacji i struktury.

Zestaw (nr produktu 11719386001) zawiera wszystkie odczynniki niezbędne do lizy komórek, solubilizacji, stabilizacji i immunopurifikacji białek.

Liza komórek i przygotowanie próbek

1. Przepłucz komórki/tkanki co najmniej dwukrotnie lodowatym PBS, aby usunąć wszelkie pozostałe białka surowicy z pożywki hodowlanej. Dla jednej reakcji immunoprecypitacji zalecana jest objętość próbki od 1 do 3 ml. Przy użyciu mikrowirówki optymalna jest objętość 1 ml.

• Komórki adherentne należy przemyć przez dodanie PBS do monowarstwy i usunięcie supernatantu. Dodać bufor lizujący schłodzony do temperatury od +2 do +8 °C do schłodzonych, umytych monowarstw komórek, aby osiągnąć stężenie od 10⁶ do 10⁷ komórek/mL. Zeskrobać komórki na jedną stronę szalki za pomocą odpowiedniego urządzenia.
• Komórki w zawiesinie należy przemyć PBS przez odwirowanie i ponowne zawieszenie osadu. Po ostatnim płukaniu usunąć supernatant. Ponownie zawiesić osad komórkowy w buforze do lizy schłodzonym do temperatury od +2 do 8°C, aby osiągnąć stężenie od 10⁶ do 10⁷ komórek/ml i przenieść do odpowiedniego urządzenia homogenizującego.
• Stałą tkankę należy przemyć przez dodanie PBS i usunięcie supernatantu. Dodaj bufor lizujący do próbki, aby osiągnąć stężenie od 5 do 20 mg tkanki/ml.

2. Przenieś próbkę do homogenizatora Dounce, wstępnie schłodzonego na lodzie lub innego typu mikro-homogenizatora. Należy pamiętać, że procedura homogenizacji może być krytyczna dla integralności funkcjonalnej docelowego antygenu. Używając tłuczka typu B, homogenizować przez wielokrotne uderzenia (ok. 10).

3. Odwirować homogenizowaną zawiesinę przy 12 000 × g, 10 minut, +2 do +8 °C w mikrowirówce stołowej w celu usunięcia zanieczyszczeń. Alternatywnie, aby przygotować supernatant o wysokiej prędkości, odwirować przy 100 000 × g, 45 minut, +2 do +8 °C.

4. Oddzielić supernatant i przenieść do probówki mikrofugurowej (optymalna objętość 1 ml).

Preclearing with Protein G Agarose

Aby zredukować tło spowodowane niespecyficzną adsorpcją nieistotnych białek komórkowych na agarozie Protein G, zalecany jest etap wstępnego oczyszczania.

5. Dodać 50 μL jednorodnej zawiesiny agarozy Protein G (objętość złoża 25 μL) do 1 do 3 ml próbki i inkubować w temperaturze +2 do +8 °C przez co najmniej 3 godziny lub przez noc na platformie kołyszącej.

6. Peletować kulki przez sedymentację grawitacyjną lub wirowanie przy 12 000 × g przez 20 sekund w mikrowirówce. Przenieść supernatanty do świeżych probówek.

Immunoprecypitacja białka docelowego

7. Dodać odpowiednią ilość specyficznego przeciwciała i delikatnie kołysać w temperaturze od +2 do +8 °C przez jedną godzinę.

8. Dodaj 50 μL jednorodnej zawiesiny agarozy Protein G do mieszaniny i inkubuj w temperaturze od +2 do +8 °C przez co najmniej trzy godziny lub przez noc na platformie kołyszącej.

9. Zebrać kompleksy przez sedymentację grawitacyjną lub wirowanie przy 12 000 × g przez 20 sekund w mikrowirówce.

10.
11. Powtórzyć kroki 9 i 10.

12. Zebrać kompleksy, jak opisano w kroku 9, usunąć supernatant, ponownie zawiesić osad w 1 ml buforu płuczącego 2, inkubować w temperaturze od +2 do +8 °C przez 20 minut na platformie kołyskowej, ponownie osuszyć kulki i usunąć supernatant.

13. Powtórzyć krok 12.

14.
15. Usunąć ostatnie ślady końcowego płukania z osadu agarozy oraz ze ścianek i pokrywki probówki mikrofugurowej.

Elektroforeza żelowa

Immunoprecypitowane białka można rozdzielić za pomocą dowolnego rodzaju jedno- lub dwuwymiarowego systemu elektroforezy zapewniającego wystarczającą rozdzielczość białka. Szczegółowy protokół elektroforezy w żelu SDS-poliakryloamidowym lub elektroforezy dwuwymiarowej można znaleźć w jednym ze standardowych podręczników lub w instrukcjach producentów sprzętu do elektroforezy.

1. Dodaj 25 do 75 μL buforu do ładowania żelu do immunoprecypitatu.
2. Denaturuj białka przez ogrzewanie do +100 °C przez 3 minuty. Usunąć agarozę Protein G przez odwirowanie z prędkością 12 000 × g przez 20 sekund w temperaturze od +15 do +25 °C w mikrowirówce. Przenieś supernatant do świeżej probówki.
3. Analizuj podwielokrotność za pomocą elektroforezy w żelu SDS-poliakryloamidowym.

Western Blotting

Po elektroforezie nanieś żel na nitrocelulozę lub membranę PVDF przy użyciu standardowego protokołu Western blot.

1. Membrany hydrofobowe, takie jak PVDF, muszą być zwilżone metanolem przez kilka sekund i nasączone buforem transferowym przez co najmniej 5 minut. Nitroceluloza powinna być krótko moczona w wodzie, a następnie przez co najmniej 5 minut w buforze transferowym.
2. Konieczne jest dokładne wyrównanie żelu w buforze transferowym przez 5 do 10 minut przed transferem.
3. Blot zgodnie ze standardowymi protokołami.
4. Blot może być przechowywany w stanie suchym przez kilka miesięcy w lodówce, jeśli to konieczne, ale musi być ponownie zwilżony przed rozpoczęciem immunodetekcji. Membrany PVDF powinny być ponownie zwilżone w metanolu lub w 5% roztworze Tween 20 (v/v).

Rozwiązywanie problemów

Brak sygnału

Przygotowanie próbki do immunoprecypitacji.

• Aby zmniejszyć ryzyko degradacji antygenu podczas przygotowywania próbki, należy dołączyć dodatkowe specyficzne inhibitory proteazy.
• Zwiększ stężenie przeciwciała pierwotnego do 5 μg/ml.
• Dla przeciwciał o niskim powinowactwie, użyj buforów płuczących o niższej surowości (np, 150 mM NaCl, bez detergentu)
• Sprawdź powinowactwo pierwotnego przeciwciała do agarozy Protein G. Jeśli powinowactwo pierwotnego przeciwciała okaże się niskie, zmień matrycę na odpowiednią.

Wykrywanie

• Sprawdź, czy białko zostało prawidłowo przeniesione na membranę podczas blottingu.Jeśli transfer nie był wydajny, szczególnie w przypadku białek o wysokiej masie cząsteczkowej, zmień warunki transferu (wydłuż czas transferu, zwiększ natężenie prądu lub zmień na alternatywne bufory transferowe.
• Brak pasm o wysokiej masie cząsteczkowej--> wydłuż czas blottingu lub zmień bufor transferowy.
• Sprawdź aktywność enzymatyczną koniugatu przeciwciał wtórnych. Nanieść różne rozcieńczenia koniugatu enzymatycznego na membranę do blottingu i bezpośrednio wykryć. Jeśli nie pojawi się sygnał, użyj świeżego koniugatu enzymu i przetestuj w ten sam sposób. Jeśli nadal nie pojawia się sygnał, sprawdź odczynnik wykrywający.

Słabe sygnały

Przygotowanie próbki i immunoprecypitacja

• Aby zmniejszyć ryzyko degradacji antygenu podczas przygotowywania próbki, należy dodać dodatkowe specyficzne inhibitory proteazy.
• Zoptymalizuj stężenie przeciwciała pierwotnego.
• Przedłuż czas inkubacji z przeciwciałem pierwotnym do kilku godzin w temperaturze od +2 do +8 °C.
• Przedłuż czas inkubacji z agarozą Protein G (przez noc).
• Skróć czas płukania. Używaj buforów płuczących o niższej surowości (150 mM NaCl, bez detergentu).

Wykrywanie

• Zwiększ ilość białka nałożonego na żel.
• Sprawdzić skuteczność blottingu.
• Przedłużyć czas wykrywania.

Wysokie tło

Przygotowanie próbki i immunoprecypitacja
<

• Próbki o wysokim tle mogą wymagać kilku rund wstępnej absorpcji w celu usunięcia wszystkich białek wiążących się niespecyficznie z białkiem G.
• Zwiększyć czas płukania kompleksu przeciwciało-białko G agaroza po immunoprecypitacji. Zwiększyć surowość warunków płukania.
• Podwyższone poziomy sygnałów tła na blotach mogą być spowodowane niespecyficznym wychwytywaniem białek podczas wirowania kompleksów agaroza-białko G/antygen. Można tego uniknąć poprzez sedymentację grawitacyjną kompleksów zamiast wirowania.

Detekcja

• Używaj czystego sprzętu, świeżo przygotowanych buforów i nowych membran.
• Rozcieńczyć stężenie białka w próbce.
• Unikać dotykania membran. Używaj rękawiczek i tępo zakończonych kleszczyków z nieząbkowanymi końcówkami.

Niespecyficzne pasma

Przed etapami immunoprecypitacji oczyść próbkę do trzech razy agarozą z białkiem G w celu usunięcia wszystkich białek wiążących się niespecyficznie z białkiem G . Jeśli immunoglobuliny surowicy nie mogą być całkowicie usunięte podczas wstępnego oczyszczania agarozą Protein G, zaleca się warunki hodowli komórkowej bez surowicy przed lizą komórek. Alternatywnie, agarozę z białkiem G można wstępnie załadować pożądaną ilością specyficznego przeciwciała, a pozostałe miejsca wiązania białka G można zablokować niespecyficznymi przeciwciałami kontrolnymi lub surowicą.