Oznaczanie kwasu askorbinowego i kwasu dehydroaskorbinowego w różnych produktach spożywczych i suplementach - proste podejście oparte na HPTLC

Markus Burholt, Scientist Instrumental Analytics R&D, Monika Bäumle, Global Product Manager Thin-Layer Chromatography

Merck

Article from Analytix Reporter - Issue 14

Wprowadzenie

Witamina C lub kwas askorbinowy to witamina występująca naturalnie w wielu owocach i niektórych warzywach lub dodawana do niektórych przetworzonych produktów spożywczych lub suplementów diety. Jest rozpuszczalna w wodzie i ma właściwości przeciwutleniające poprzez degradację do kwasu dehydroaskorbinowego. Organizm ludzki nie może wytwarzać kwasu askorbinowego i musi on być spożywany z pożywieniem lub suplementami. Pełni ona istotne funkcje w organizmie człowieka i utrzymuje wiele procesów życiowych. W przypadku niedoboru witaminy C (szkorbut) mogą wystąpić objawy, takie jak zmęczenie, znużenie i stany zapalne. Zalecana dzienna dawka kwasu askorbinowego wynosi około 100 mg dziennie i można ją łatwo osiągnąć stosując zdrową, zbilansowaną dietę. Zazwyczaj kwas askorbinowy jest oznaczany ilościowo za pomocą miareczkowania jodometrycznego zgodnie z metodą USP.¹ Wymagana jest dodatkowa identyfikacja substancji i przeprowadzana np. za pomocą analizy w podczerwieni.¹

W poniższej aplikacji pokazujemy łatwe i szybkie podejście przesiewowe do jednoczesnej analizy ilościowej kwasu askorbinowego i kwasu dehydroaskorbinowego za pomocą wysokosprawnej chromatografii cienkowarstwowej (HPTLC). Chromatografia cienkowarstwowa (TLC) i HPTLC są wygodnymi, szybkimi i wydajnymi technikami separacji, które umożliwiają rozwój metod analitycznych bez potrzeby intensywnego przygotowywania próbek lub wysokich inwestycji.² W połączeniu z MS możliwa jest późniejsza identyfikacja substancji. Niski koszt i krótki czas analizy na próbkę są zapewnione przez równoległą analizę kwasu askorbinowego w produktach spożywczych na jednej płytce. Ponadto, wysoka tolerancja matrycy TLC oferuje dodatkowe możliwości dla istniejących rutynowych metod. Wysoka lepkość i wysoka zawartość cukru w wielu produktach zawierających kwas askorbinowy (np. soki owocowe) sprawia, że są to bardzo złożone i bogate w matrycę próbki do analizy.

Warunki eksperymentalne

Pięć różnych dostępnych na rynku produktów zawierających kwas askorbinowy, takich jak koncentrat soku, gumy owocowe, tabletka musująca z witaminą C, tabletka musująca z wieloma witaminami oraz tabletka z ekstraktem z żurawiny, analizowano w warunkach przedstawionych w Tabeli 1.

.

Ze względu na swoją zdolność utleniania, kwas askorbinowy ulega szybkiemu rozkładowi i powstaje kwas dehydroaskorbinowy. Wiarygodne oznaczenie ilościowe kwasu askorbinowego może być trudne i wymaga delikatnej, ale szybkiej analizy próbek. W praktyce kwas askorbinowy może być oznaczany ilościowo wraz z niewielką ilością jego produktu dehydratacji - kwasu dehydroaskorbinowego. (Rysunek 1). Aby zasymulować ten efekt, w tym eksperymencie wzorce kwasu askorbinowego zostały przesycone kwasem dihydroksyaskorbinowym.

Rysunek 1. Struktura chemiczna kwasu askorbinowego i kwasu dehydroaskorbinowego.

Krzywe kalibracji kwasu askorbinowego i kwasu dehydroaskorbinowego zostały ustalone w oparciu o 3 różne zastosowane objętości standardowe (Tabela 2). Po rozdzieleniu przeprowadzono szybkie i proste potwierdzenie substancji za pomocą MS.³

Próbki i wzorce zostały naniesione pasmowo (6,0 mm). Najpierw zastosowano serię stężeń wzorców kwasu askorbinowego, a następnie naniesiono na nie wzorce kwasu dehydroaskorbinowego. Ze względu na spodziewane niższe stężenie kwasu dehydroaskorbinowego, objętość próbki była mniejsza niż w przypadku kwasu askorbinowego.

Płytkę rozwinięto za pomocą fazy ruchomej, a następnie wysuszono w temperaturze 50 °C do całkowitego wyschnięcia. W celu oznaczenia ilościowego płytkę ogrzewano w temperaturze 110 °C przez 10 minut. Badanie płytki przeprowadzono przy długości fali 366 nm.

Wyniki i dyskusja

Przy oświetleniu 366 nm kwas askorbinowy pojawia się przy hR_f 45, a kwas dehydroaskorbinowy przy hR_f 58 (Rys. 2). Pomiar MS plamek (przed ogrzewaniem) został przeprowadzony w celu potwierdzenia identyfikacji substancji.³

Rysunek 2. Wizualizacja płytki pod UV 366 nm. Kwas askorbinowy pojawia się przy hR_f 45, a kwas dehydroaskorbinowy przy hR_f 58.

Profile roztworu kalibracyjnego (Tabela 2) przy długości fali 366 nm zostały wykorzystane do ustalenia krzywych kalibracyjnych i oznaczenia ilościowego (Tabela 3, Rysunek 3 &4) w odniesieniu do ilości naniesionej na płytki.

Rysunek 3. Wykres kalibracyjny z odpowiednią funkcją kalibracji kwasu askorbinowego.

Rysunek 4. Wykres kalibracyjny z odpowiednią funkcją kalibracji kwasu dehydroksyaskorbinowego.

Dane kalibracyjne zostały wykorzystane do ilościowego określenia zawartości witaminy C w pięciu zastosowanych próbkach. We wszystkich 5 próbkach można było oznaczyć kwas askorbinowy, a także kwas dehydroaskorbinowy. Wyniki przedstawiono w Tabeli 4 a & b.

 

.

Wnioski

Opracowana procedura aplikacji zapewnia prostą metodę opartą na analizie kwasu dehydroaskorbinowego i askorbinowego w różnego rodzaju próbkach i matrycach za pomocą HPTLC. To łatwe i proste podejście stanowi alternatywną metodę wiarygodnego badania przesiewowego witaminy C w próbkach żywności i napojów.

Zapewnia szybką, ekonomiczną i prostą półilościową analizę kwasu askorbinowego i kwasu dehydroksyaskorbinowego, a także demonstruje główne zalety metody TLC, takie jak szybkie przygotowanie próbki, wysoka tolerancja matrycy i wysoka przepustowość.

Aby dowiedzieć się więcej na temat zastosowań do testowania żywności zobacz SigmaAldrich.com/food.

Referencje

1. United States Pharmacopeia (2022). USP Monographs Dietary Supplement Monographs NF Monographs, Ascorbic Acid. USP-NF. Rockville, MD: United States Pharmacopeia. https://doi.org/10.31003/uspnf_m6030_04_01

2. Schulz M, Oberle M, Burholt M, Baeumle M. 50 years of TLC-MS Thin-Layer Chromatography coupled to Mass Spectrometry and new perspectives by complementary use to HPLC as demonstrated in testing of honey Analytix Reporter. 2019;5: 3-7. [Internet]. Available from: https://www.sigmaaldrich.com/analytix

3. Unpublished results. Contact the author to get more details.