Wskazówki dotyczące wyboru barwników do cytometrii przepływowej

Cytometria przepływowa zależy od połączenia fluoroforów i przeciwciał specyficznych dla celu jako odczynników wykrywających.Wiele przeciwciał stosowanych w cytometrii przepływowej jest bezpośrednio sprzężonych z barwnikami fluorescencyjnymi (inaczej fluoroforami). Jednak wiele nieznakowanych przeciwciał pierwotnych jest również rutynowo stosowanych w połączeniu ze znakowanymi przeciwciałami wtórnymi.Czytaj dalej, aby dowiedzieć się, jak wybrać barwniki do cytometrii przepływowej, w tym szybkie wskazówki dotyczące wyboru barwników do cytometrii przepływowej, takie jak dopasowanie profili fluorescencji fluoroforów do konfiguracji cytometrów przepływowych, czynniki, które mogą wpływać na wydajność fluoroforu w panelu wielokolorowym oraz pomocne narzędzia do prostego wyboru barwnika.

Czytaj więcej

• Czym są fluorofory?
• Dopasowanie profili fluorescencji do konfiguracji cytometrów przepływowych
• Czynniki wpływające na wydajność fluoroforów w panelach wielokolorowych
• Wskazówki dotyczące wyboru odpowiednich barwników fluorescencyjnych
• Powiązane produkty

Czym są fluorofory?

Fluorofory to naturalne lub sztuczne cząsteczki, które mogą być wzbudzane przez światło o określonej długości fali, a następnie mogą emitować światło o niższej energii i większej długości fali.  Profile wzbudzenia i emisji są charakterystycznymi cechami każdego fluoroforu.Dlatego wybór fluoroforu jest kluczowym krokiem w cytometrii przepływowej.  

Fluorofor a fluorochrom

Terminy "fluorofor" i "fluorochrom" są często używane zamiennie w literaturze na temat cytometrii przepływowej. Jednak "fluorofor" ogólnie odnosi się do poszczególnych cząsteczek, które same fluoryzują, jak opisano powyżej. Natomiast "fluorochrom" odnosi się do barwników fluorescencyjnych stosowanych w barwieniu biologicznym przed badaniem cytometrii przepływowej.

Dopasowanie profili fluorescencji do konfiguracji cytometrów przepływowych

Konieczne jest dopasowanie profilu fluorescencji każdego fluoroforu do konfiguracji optycznej cytometru przepływowego. Pierwszym krokiem jest poznanie konfiguracji używanego cytometru przepływowego, takiej jak liczba i rodzaje laserów i filtrów, w które jest wyposażony. Lasery muszą emitować światło o długości fali zbliżonej do maksymalnej długości fali wzbudzenia wybranego fluoroforu. Ponadto filtry muszą być odpowiednie do wykrywania światła, które jest najbliższe maksymalnej długości fali emisji fluoroforu (fluoroforów).

Factors Affecting Fluorophore Performance in Multicolor Panels

.W ciągu ostatniej dekady lista fluoroforów lub barwników fluorescencyjnych odpowiednich do cytometrii przepływowej znacznie wzrosła, aby pomóc zaspokoić potrzebę jednoczesnego wykrywania wielu markerów w danej populacji komórek. Doprowadziło to do pojawienia się wysokoprzepustowej lub analiza wielokolorowej cytometrii przepływowej, która oferuje zalety:

• Generowanie szczegółowej analizy komórek w mieszanej populacji komórek
• Umożliwienie naukowcom badania skuteczności leków wobec różnych typów komórek<
• Umożliwienie analizy interakcji białko-białko 

Pragnienie wielokolorowych eksperymentów cytometrii przepływowej postawiło kilka wyzwań.Naukowcy muszą stosować kilka kryteriów wyboru odpowiednich barwników lub fluoroforów, aby uniknąć błędnych wyników podczas projektowania wielokolorowych paneli cytometrii przepływowej.Tam, gdzie używany jest panel fluoroforów, najlepiej jest rozprowadzić fluorofory tak szeroko, jak to możliwe w laserach i filtrach, aby zmniejszyć wszelkie możliwe zakłócenia w analizie.Wydajność fluoroforu i jego użyteczność w panelu wielokolorowym zależy od następujących czynników:

• Profile wzbudzenia i emisji
• Względna jasność
• Wydajność kwantowa
• Nakładanie się emisji
• Stabilność koniugatu przeciwciała z fluoroforem
• Powtarzalność koniugacji przeciwciał

Wskazówki dotyczące wyboru odpowiednich barwników fluorescencyjnych

Następujące kilka wskazówek może być przydatnych przy wyborze odpowiednich barwników fluorescencyjnych lub fluoroforów w analizie cytometrii przepływowej.

• Upewnij się, że profil fluoroforu pasuje do konfiguracji optycznej cytometru przepływowego.
  
• Zawsze bierz pod uwagę maksima wzbudzenia i emisji, jak również przesunięcie Stokesa w projektowaniu eksperymentów cytometrii przepływowej podczas korzystania z panelu przeciwciał.  
• Wybierz najjaśniejszy zestaw fluoroforów dla konfiguracji instrumentu cytometru przepływowego. 
• Wybierz fluorofory, które pomogą zminimalizować nakładanie się widm.
• Zachowaj najjaśniejsze fluorofory dla słabszych przeciwciał i odwrotnie. 
• Unikaj rozlewania się z jasnych populacji komórek do detektorów, które wymagają wysokiej czułości dla tych populacji.
• Rozważ fotostabilność każdego fluoroforu, a także jego stabilność po utrwaleniu w zależności od potrzeb eksperymentalnych.
• Chociaż stosowanie fluoroforów o nienakładających się widmach emisji jest idealne, kontrole kompensacyjne lub kulki kontrolne mogą być stosowane w celu zapewnienia, że wykryte światło jest przypisane do właściwego fluoroforu podczas multipleksowania.  
• Upewnij się, że wrażliwość na inne stosowane odczynniki, takie jak środki lizujące, utrwalacze itp. jest ograniczona lub nie występuje wcale.