Jak wybrać przeciwciało drugorzędowe

Poniższe informacje mają na celu pomóc w podjęciu decyzji, które przeciwciało wtórne może być najlepsze dla konkretnego zastosowania.

Pytania

1. W jakim gatunku zostało opracowane pierwotne przeciwciało?
2. Jaka jest klasa (izotyp) i/lub podklasa pierwotnego przeciwciała?
3. Czy użyć przeciwciała oczyszczonego metodą powinowactwa lub frakcji IgG?
4. Jaki rodzaj etykiety wybrać?
5. Kiedy powinienem użyć wstępnie adsorbowanego przeciwciała wtórnego?
6. Kiedy konieczne jest użycie przeciwciała F(ab) lub F(ab')₂ fragment?
7. Jak rozszyfrować nomenklaturę przeciwciał drugorzędowych?

W jakim gatunku powstało pierwotne przeciwciało?

Przeciwciała wtórne są skierowane przeciwko gatunkowi pierwotnego przeciwciała. Dlatego potrzebne będzie przeciwciało wtórne, które zostało wyhodowane w gatunku innym niż gatunek gospodarza przeciwciała pierwotnego. Na przykład, jeśli przeciwciało pierwotne zostało wyhodowane u myszy, potrzebne będzie przeciwciało wtórne przeciwko myszy wyhodowane u kozy, królika itp.

Jaka jest klasa (izotyp) i/lub podklasa pierwotnego przeciwciała?

To pytanie jest przede wszystkim ważne podczas pracy z przeciwciałami monoklonalnymi. Przeciwciała poliklonalne są jednak zazwyczaj immunoglobulinami klasy IgG. Z tego powodu przeciwciała drugorzędowe będą głównie przeciwciałami anty-IgG.

Przeciwciała monoklonalne są najczęściej opracowywane u myszy, a czasami u szczurów, chomików lub królików. Na przykład, jeśli pierwotnym przeciwciałem monoklonalnym jest mysie IgM, potrzebne będzie przeciwciało drugorzędowe, które reaguje z mysim IgM (anty-Mysie IgM).

Jeśli pierwotnym przeciwciałem monoklonalnym jest jedna z podklas mysich IgG, prawie każde przeciwciało drugorzędowe anty-Mysie IgG powinno się z nim wiązać. Jeśli podklasa pierwotnego przeciwciała nie jest znana, można użyć przeciwciał drugorzędowych anty-Mouse IgG F(ab), ponieważ rozpoznają one większość podklas mysich immunoglobulin.

Istnieje wiele klas i podklas ludzkich i mysich IgG. Wybór drugorzędowego może być trudny. Jednak jednym wspólnym czynnikiem wśród tych IgG są łańcuchy lekkie (kappa i lambda). Innymi słowy, IgG, IgM, IgA, IgD i IgE mają łańcuchy lekkie kappa lub lambda. Łańcuch ciężki jest jednak specyficzny dla danej klasy.

Podsumowanie klas i podklas immunoglobulin

• Klasy immunoglobulin: IgG, IgM, IgA, IgE, IgD
• Podklasy ludzkich immunoglobulin: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2
• Podklasy immunoglobulin mysich: IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3
• Łańcuchy lekkie: Kappa, Lambda
• Łańcuchy ciężkie: IgG (gamma), IgM (mu), IgA (alfa), IgD (delta), IgE (epsilon)

Dodatkowe informacje o reaktywności przeciwciał

• Poliwalentne: reagują ze wszystkimi klasami
• Anti-Fc i specyficzne dla łańcuchów ciężkich: reagują tylko z łańcuchami ciężkimi; dlatego są specyficzne dla klasy.
• Anti-Fab i specyficzne dla całej cząsteczki: reagują z łańcuchami ciężkimi i lekkimi. Ze względu na reaktywność łańcucha lekkiego mogą reagować ze wszystkimi klasami.
• Swoiste dla łańcucha lekkiego (kappa, lambda): reagują ze wszystkimi klasami, ponieważ wszystkie klasy używają tych samych łańcuchów lekkich kappa lub lambda.

Czy używać przeciwciała oczyszczonego metodą powinowactwa lub frakcji IgG?

Większość osób preferuje przeciwciała wtórne izolowane metodą powinowactwa, ponieważ zapewniają one najmniejszą ilość niespecyficznego wiązania. Jednak w niektórych przypadkach można rozważyć frakcje IgG, tj. gdy antygen będący przedmiotem zainteresowania jest rzadki lub występuje w niskiej obfitości. W takich sytuacjach wymagane są przeciwciała o wysokim powinowactwie. Na przykład, podczas izolacji powinowactwa, niektóre z przeciwciał o bardzo wysokim powinowactwie mogą zostać usunięte, ponieważ wiążą się tak ściśle z matrycą powinowactwa, że nie są w stanie zostać wymyte.

Jaki rodzaj etykiety wybrać?

Etykieta jest bardzo zależna od zastosowania. W przypadku immunoblottingu i ELISA najpopularniejsze są przeciwciała wtórne znakowane enzymatycznie. Peroksydaza jest ekonomicznym i ogólnie bardziej stabilnym enzymem niż fosfataza alkaliczna. Stała się również bardzo popularna do stosowania w chemiluminescencyjnych systemach detekcji. Z drugiej strony, fosfataza alkaliczna jest uważana za bardziej czułą niż peroksydaza, szczególnie w przypadku wykrywania kolorymetrycznego.

Do barwienia komórek lub tkanek można stosować fosfatazę alkaliczną, peroksydazę lub przeciwciała drugorzędowe sprzężone z fluorochromem. Typowymi fluorochromami są FITC, fikoerytryna, barwniki CF™, barwniki Atto i czerwień kwantowa. Powiązane zastosowania to immunocytochemia/immunofluorescencja, cytometria przepływowa lub immunohistochemia.

Aby wygenerować zwiększone wzmocnienie, można zastosować dwuetapowy system biotyna/awidyna. Biotyna wiąże się z bardzo wysokim powinowactwem do awidyny, powodując zasadniczo nieodwracalną interakcję. Najpierw stosuje się biotynylowane przeciwciało drugorzędowe, a następnie awidyna, ExtrAvidin lub streptawidyna sprzężona z enzymem lub fluorochromem wiąże się z wieloma miejscami na biotynylowanym przeciwciele drugorzędowym, wzmacniając w ten sposób sygnał i powodując większą czułość niż osiągana przy użyciu samego koniugatu przeciwciało-enzym lub przeciwciało-fluorochrom.

Kiedy należy stosować wstępnie adsorbowane przeciwciało drugorzędowe?

Użycie wstępnie adsorbowanych przeciwciał zmniejszy niespecyficzne tło podczas pracy z tkankami i komórkami. Proces polega na przepuszczeniu przeciwciała wtórnego przez unieruchomione białka surowicy z potencjalnie reaktywnych krzyżowo gatunków. Dlatego, jeśli pracujesz z ludzkimi tkankami, wybierz przeciwciało wtórne, które zostało zaadsorbowane ludzką surowicą lub ludzką IgG.

Kiedy przeciwciało F(ab) lub F(ab')₂ fragment jest niezbędne?

Jeśli pracujesz z tkankami lub komórkami, które mają receptory Fc, wybierz F(ab) lub F(ab')₂ fragment, jeśli to możliwe, aby wyeliminować niespecyficzne wiązanie.Bardziej szczegółowo, fragmenty F(ab')₂ przeciwciał są stosowane w systemach testowych, w których obecność regionu Fc może powodować problemy. Próbki takie jak węzły chłonne, śledziona i preparaty krwi obwodowej zawierają komórki z receptorami Fc (makrofagi, limfocyty B i komórki naturalnych zabójców), które mogą wiązać region Fc nienaruszonych przeciwciał, powodując wysokie zabarwienie tła. Użycie fragmentów F(ab')₂ zapewnia, że wszelkie zaobserwowane wiązanie przeciwciał nie jest spowodowane przez receptory Fc.

Jak rozszyfrować nomenklaturę przeciwciał drugorzędowych?

Przeciwciało anty-Goat IgG (H+L), wysoce adsorbowane krzyżowo, CF™ 568 wyprodukowane u osła

• Anti-Goat IgG: Nazwa gatunku, przeciwko któremu skierowane jest przeciwciało
• (H + L): Opis swoistości przeciwciała dla łańcuchów ciężkich i lekkich
• Wysoka absorpcja krzyżowa: Przeciwciało zostało zaabsorbowane do surowicy wielu różnych gatunków
• Przeciwciało CF™ 568: Opis etykiety wykrywającej
• Donkey: Gatunek gospodarza przeciwciała wtórnego